Молекулярное фермерство: меняем резиновые сапоги на медицинские перчатки

И он пришел к выводу, что тот, кто сможет вырастить два кукурузных початка или два колоса там, где раньше рос только один, будет иметь больше заслуг перед человечеством и лучше послужит своей стране, нежели все племя политиков, вместе взятых.

Джонатан Свифт,
«Путешествие к великанам»

Уже около тридцати лет фармацевтика синтезирует белки, необходимые для лечения гормональных, онкологических, сердечно-сосудистых заболеваний. Белки кодируются генами. Гены можно переносить из одних организмов в другие. Технология называется генной или генетической инженерией, полученные же организмы генетически модифицированными, или трансгенными. Синтез белков происходит в трансгенных микроорганизмах, а сравнительно недавно стали использовать клетки млекопитающих и насекомых. Некоторые скажут: «А зачем это? Хочу иметь лекарство из природных источников!» Пожалуйста, но… природный препарат не всегда полностью совместим с человеческим организмом, например, инсулин из свиньи все-таки уступает человеческому, а иногда источником получения ценного препарата является только плацента или абортированные человеческие эмбрионы. Иногда стоимость таких лекарств — просто запредельна для обычного гражданина, особенно в нашей стране. Так что без генной инженерии не обойтись — лишь она позволяет белок из одного организма формировать в клетке другого, причем в больших объемах. Поэтому производство рекомбинантных белков, то есть полученных генноинженерным путем, является важнейшей частью современной биотехнологии.

С производственной и биологической точек зрения у растений есть целый ряд преимуществ перед бактериями и животными клетками. Они, например, умеют синтезировать многие белки с полным набором функций, как, например, моноклональные антитела, что совершенно не могут бактерии. Их гораздо легче размножать, и стоимость их выращивания намного ниже, чем работа с культурой животных клеток. И с биологической точки зрения растения безопаснее, потому что не содержат вирусов и прионов, которые специфичны для человека и могут содержаться в препаратах, изготовленных из клеток млекопитающих. Нет в растениях и эндотоксинов, которые имеются в бактериальных клетках. Уже более 15 лет ученые пытаются создать на основе растений системы биосинтеза рекомбинантных фармацевтических белков. Даже название было придумано для этого рода человеческой деятельности — molecular farming («молекулярное фермерство»).

Первые работы в молекулярном фермерстве велись путем получения трансгенных растений со встроенными генами антител, фармацевтических белков, вакцин. На основании этих работ было показано, что растения действительно накапливают полностью функциональные белки, в том числе и антитела. Кроме всего прочего, эти работы дали толчок новому направлению — созданию съедобных вакцин.

Растения могут синтезировать некоторое количество белка — полипептида, который несет антигенную детерминанту, способную вызвать иммунный ответ. Сам по себе такой белок совершенно лишен патогенных свойств, так как это не бактерия и не вирус, а всего лишь часть протеина, который в природе находится на поверхности патогена. Этот полипептид и будет рекомбинантной вакциной, в отличие от традиционных вакцин — ослабленных или убитых микроорганизмов или вирусов, известных со времен Пастера. После возникновения иммунного ответа на этот белок человеческий организм способен бороться и с самими бактериями и вирусами, имеющими такую антигенную метку на своей поверхности. Оказалось, что в некоторых случаях такой белок-вакцину можно и не очищать — достаточно съесть банан, яблоко, листочек салата, которые содержат этот полипептид, чтобы получить иммунитет против болезней. Американцы даже создали сухой завтрак из кукурузы, содержащий вакцину против диареи, которую вызывают некоторые штаммы кишечной палочки. В связи с угрозой биологического терроризма существуют проекты по созданию съедобных растительных вакцин против сибирской язвы, холеры, чумы и т.д.

Иногда трансгенные растительные клетки не выращивают до целых растений, а культивируют в стерильных условиях на искусственной питательной среде, подобно микроорганизмам или животным клеткам. Таким путем компания Dow AgroSciences (США) разработала и сейчас готовит к продажам вакцины от болезни Ньюкасла у птиц, а израильская компания Protalix в предклинических испытаниях проверяет фермент глюкоцереброзидазу, который производится трансгенными клетками моркови. Такой фермент является ключевым в ферментно-заместительной терапии болезни Гоше (при этой наследственной болезни происходит резкое снижение умственных способностей). Годовая стоимость такого препарата, полученного из плаценты, оценивается в 300—400 тыс. долл. для одного больного, но синтез фермента в растительных клетках позволит значительно снизить эту цену.

Однако молекулярное растениеводство на основе трансгенных растений еще не получило широкого развития по ряду обстоятельств. В Европе пока существует определенное предубеждение против самого понятия «трансгенные растения». Иногда это приводит к появлению проектов по выращиванию в Исландии, подальше от континента, трансгенного ячменя для производства рекомбинантных белков. Однако предубеждения — не самое главное. В области медицины генетическая инженерия в Европе занимает определенное место, рекомбинантные белки производятся в клетках микроорганизмов или млекопитающих на заводах крупных европейских фармацевтических компаний. Основные проблемы в другом — низкий уровень содержания необходимого продукта (около 1% и менее от общего белка) и относительно длительное время от получения первых растений до массового производства. Необходимо было найти способ увеличения накопления нужного белка в растениях и сократить время от создания генетической конструкции до получения продукта.

Вирусы растений — вот возможный выход. После попадания вирусной РНК в клетках растения происходит стремительное накопление вирусных белков. Вирусы переносятся из одной клетки в другую. Никакой генетической трансформации самого растения не требуется. Несколько лет понадобилось ученым из компании Large Scale Biology Сo. (США) для создания системы производства рекомбинантных белков на основе вируса табачной мозаики. С помощью этой системы удалось получить персонализированные вакцины для лечения одной из злокачественных лимфом у людей. Сейчас испытывается вакцина для профилактики заболеваний у кошек. Для производства белков по этому способу был построен целый завод в штате Кентукки, известном своими табачными плантациями. «Табак — не для курения» — вот лозунг этой компании.

Однако и этот способ производства белков в растениях не лишен недостатков. Вирус табачной мозаики легко выбрасывает нужный нам ген и возвращается к исходному, как говорят ученые, «дикому» состоянию. Зараженное растение перестает производить необходимый продукт.

А нельзя ли объединить систему генетической трансформации растений с вирусной системой синтеза белка? Причем так, чтобы от трансформации сохранилась только система доставки ДНК в растительную клетку, может быть и без самой трансформации растительного генома, а от вирусов — только синтез белка, возможно, и без образования вирусных частиц. Природный «генный инженер» у растений — это бактерия Agrobacterium tumefaciens. С ее помощью получены многие трансгенные растения, которые уже выращиваются в мире на площади более 80 млн. гектаров. На основе плазмиды, маленькой кольцевой молекулы ДНК, взятой у этой бактерии, были созданы специальные системы переноса генетической информации в растения — векторы.

В нашем случае в такой вектор были встроены специальные последовательности ДНК, которые кодировали вирусную РНК полимеразу (это фермент, считывающий информацию и синтезирующий так называемую информационную РНК, матрицу для синтеза белка). В конструкции был также встроен ген, кодирующий интересующий нас белок под контролем специальных последовательностей, которые впоследствии будут узнаваться вирусной РНК полимеразой. Эта генетическая конструкция может переноситься в клетки растения с помощью механизмов, существующих у Agrobacterium. Предполагалось, что такая система может заработать в растительной клетке и без встраивания в геном растения, а сразу после того как ДНК вектора окажется в ядре клетки. Считывание гена и образование белкового продукта называется экспрессией, а если такая экспрессия происходит без встраивания чужеродного гена в геном трансформируемого организма, то говорят, что это транзиентная, то есть временная экспрессия. В принципе, транзиентная экспрессия может происходить с любой попавшей внутрь ядра клетки генетической конструкцией. Количество белка, образующегося в результате такой экспрессии, небольшое, и ранее никто из исследователей не ставил задачу использовать это явление для практических целей. Однако включение вирусной РНК полимеразы в векторную конструкцию, оптимизация структуры самой конструкции, подбор растительного хозяина привели к подлинной революции.

Для того чтобы проследить накопление необходимого продукта в растительной клетке, нужен репортер, то есть вещество, накопление которого можно легко зафиксировать, желательно визуально. В качестве последнего чаще всего используют ген белка, обнаруженного у медузы. Этот белок способен флуоресцировать при освещении его ультрафиолетом, и потому его называют GFP, что в переводе с английского звучит как зеленый флуоресцирующий белок. Ген этого белка был включен в вектор. В принципе почти все растения могут быть потенциальными донорами для таких генетических конструкций. Но лучшие результаты пока получены для некоторых родственников табака родом из Австралии. В листьях одного из австралийских табаков, обработанных специальной векторной конструкцией, через одну-две недели почти все растительные белки исчезали и накапливался (до 80%) GFP. То есть вся машина сборки белков переключилась на биосинтез нужного нам протеина. Растения просто излучали изумрудное сияние, когда на них направляли ультрафиолетовый свет (обычные растения флуоресцируют красным светом).

Система транзиентной экспрессии генов в листьях растений была проверена для самых разных рекомбинантных белков. Конечно, одних белков накапливалось больше, других меньше, но принцип работал как для небольших по размеру протеинов, например, человеческий интерферон, так и для совершенно громадных, таких как полноразмерные антитела, включающие малую и большую полипептидные цепи. При подсчете оказалось, что из одного килограмма растительной биомассы можно получить 1—5 граммов нужного продукта. А некоторые фармацевтические белки баснословно дороги. Стоит себе растеньице в горшочке, а каждый его листочек стоит тысячу долларов.

Таким же способом можно синтезировать вакцины. Причем в эпоху быстро меняющихся биологических угроз и мутирующих возбудителей болезней такой подход за очень короткое время позволяет организовать производство необходимых вакцин.

Кому же принадлежит авторство этой технологии? Хотя наука не имеет границ, у ученых есть родина. Статьи, которые рассказали об этой технологии, были напечатаны в Докладах Национальной академии наук США (PNAS) и Нэйчур Биотехнолоджи (Nature Biotechnology). Половина авторов являются представителями Украины, включая и руководителя этих работ Юрия Глебу, директора Института клеточной биологии и генетической инженерии Национальной академии наук Украины. Благодаря тесным связям института с компанией Icon Genetics эти достижения тут же стали использоваться в Украине для разработки способов производства фармацевтических белков. С помощью этой технологии в Киеве синтезированы первые образцы антивирусного препарата — интерферона и гормона роста — соматотропина и показана их биологическая эквивалентность.

Технология, описанная выше, хотя и очень удачный, но всего лишь один из примеров современного молекулярного фермерства. Соединение генетической инженерии и растениеводства — одно из главных направлений современной биотехнологии. Оно уже не только приносит миллиардные прибыли ведущим западным странам, но и дает надежду не самым богатым людям иметь доступ к современным медицинским препаратам по приемлемым ценам.